新型冠状病毒核酸检测过程中灵敏度损失的定量分析

新型冠状病毒是迄今为止发现的第七种感染人体的冠状病毒，属于单股正链ＲNA病毒，其基因组大小为27～31kb。之前发现的6种冠状病毒中，229E、OC43、NL63以及HKU可引起轻微呼吸道疾病，SAＲS冠状病毒和MEＲS冠状病毒则能够引起严重呼吸道疾病。根据血清学和基因组特点，冠状病毒可分为α，β，γ，δ四个属，此次分离得到的新型冠状病毒属于β型。根据当前新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)的规定，疑似病例同时具备以下病原学或血清学证据(实时荧光ＲT-PCＲ检测新型冠状病毒核酸阳性、病毒基因测序与已知新型冠状病毒高度同源、血清新型冠状病毒特异性IgM和IgG抗体阳性、血清新型冠状病毒特异性抗体IgG抗体由阴性转为阳性或恢复期较急性期4倍及以上升高)之一，即可确诊为新型冠状病毒肺炎患者。考虑到全球各地的复杂情况，新型冠状病毒短期内得到完全控制的可能性很小，这就对检测技术的灵敏度、检测流程的合理性以及一次性病毒采样管内检测试剂质量的可靠性提出了较高的要求。

由于病毒基因组测序对技术、设备、操作人员的要求较高，特异性抗体检测具有较长窗口期，而核酸扩增的方法具有窗口期短、检测灵敏度高的优点，因此通过实时荧光PCＲ检测新型冠状病毒成为各大医院的选择。然而根据全国新型冠状病毒核酸检测室间质量评价结果报告，样本号2020002(即阳性参考品浓度为640copies/mL时)，实时荧光PCＲ检测的符合率仅有84．9%，同时复检率高达30．7%，转录介导的恒温扩增方法符合率仅有60%，复检率高达40%，说明现有核酸检测方法存在弊端，在样品浓度偏低时，假阴性现象非常明显。临床数据显示，新冠病毒潜伏期大约为14d，个别患者甚至达到29d，病毒在潜伏期时数量增长及临床症状不明显。这部分新冠病毒感染者的发病周期长，前期病毒载量少，不易于检测确诊，但其感染性却未降低，目前的检测方法对于这部分病毒载量较低感染者的筛查非常容易漏检。

新型冠状病毒核酸检测整个流程分为样本采集、样本处理、上机检测3个步骤，越是靠前的步骤，对于检测结果的影响也越大，尤其是对阳性临界样本。关于样本采集，各个医院和专家已达成共识:普通棉签拭子的核酸检出率明显低于带病毒保存液的植绒拭子，下呼吸道标本检出率高于上呼吸道标本检出率。不同样本类型新型冠状病毒核酸检出率从高到低排序依次为:支气管肺泡灌洗液＞抽吸痰或咳痰＞鼻咽拭子或口咽拭子＞鼻拭子。大部分厂家和机构都充分考虑了样本检测的环节，但是在样本处理环节却少有考虑。

目前磁珠法作为临床检测的主流方法，优点是易于实现全自动提取，在节约人力和时间方面具有优势，缺点是难以处理大体积的样本。离心柱法的核酸提取效果优于磁珠法，在检测灵敏度方面具有优势而且利于较大限度地利用样本，但缺点是不利于自动化处理，所以综合两种方法的优势，开发全自动的柱提取法将对医院大批量的样本检测带来帮助。考虑到自动化的重要性，用真空法过柱可能是一个有潜力的发展方向。保存液的pH会影响样本核酸的挂柱效果，本研究发现，随着保存液pH的降低，检测所得的Ct值也降低，表明低pH更有利于假病毒样本的核酸提取。在保存液的利用方面，本研究分别取2005L和3mL保存液提取核酸，Ct值相差3.68，根据Ct值与反应体系中模板量的线性关系可得知，这相当于检测灵敏度相差10倍以上，表明可在实际检测中尽可能充分地利用样本保存液，有利于减少假阴性现象的出现。

值得注意的是，当病毒采样管内保存液体积分别为1,2,3mL时，最终检测所得的Ct值差异无统计学意义，表明不同体积的保存液中假病毒的浓度几乎相同。这一结果也说明，不同体积保存液洗脱病毒的效率差异很大，当保存液体积变小时，从拭子上洗脱的假病毒总量也减少，导致洗脱下来的假病毒浓度基本保持不变。因此在实际检验中，过少的保存液体积并不能带来更高浓度的病毒溶液，应当适当增大保存液的体积，这有利于拭子上的病毒样本充分释放。为了探究最合适的保存液体积，本研究用添加到拭子上和直接添加两种方式，分别将相同数量假病毒分别添加到保存液中，发现保存液体积采用IrL.2rL时，两种方式的Ct值分别相差1.38.0.59，表明拭子上的假病毒样本并没有完全释放到保存液中，并且随着保存液体积增大，假病毒也释放得更充分;当保存液体积达到3mL时，两种方式的Ct值相差0.11，假病毒接近完全洗脱，因此3mL是一个比较理想的保存液体积。

本研究采用离心柱法进行样本的RNA提取，使用无核酸酶的水洗脱，这样所纯化的RNA较纯挣，抑制成分较少。随着反应体系中RNA模板的量增大，Ct值相应减小。检测临床样本时，在尽量去除PCR抑制成分的前提下，增加PCR体系中的模板量有利于提高检测灵敏度。

基于以上研究，本研究提出了最优的检测方案:在正确取样的前提下，使用偏酸性的样本保存液，并采用理想的保存液体积，将尽量多的保存液采用柱法提取核酸，最后将较大限度的核酸加入PCH体系。将最优检测方案和目前常规操作进行对比，发现两种方案的检测灵敏度相差10倍。因此采用本研究的最优方案可以较大限度地提高实际检测灵敏度，减少核酸检测的假阴性现象。